Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Механизм разделения заключается в следующем. В нейтральной или щелочной среде возникает сильный электроосмотический поток, который перемещает ионы буферного раствора, используемого при разделении, по направлению к катоду. Если в качестве поверхностно-активного вещества используется натрия додецилсульфат электрофоретическая миграция анионных мицелл происходит в противоположном направлении, т.е. к аноду. В результате общая скорость миграции мицелл уменьшается по сравнению с потоком раствора электролита. В случае нейтральных разделяемых веществ, поскольку аналит способен распределяться между мицеллой и водным буферным раствором и не имеет электрофоретической подвижности, скорость миграции аналита будет зависеть только от величины его коэффициента распределения между мицеллой и водным буферным раствором. На электрофореграмме пики, соответствующие каждому из разделяемых незаряженных веществ, всегда находятся между пиком маркера электроосмотического потока и пиком мицеллы (время между этими двумя пиками называется окном разделения). Для заряженных разделяемых веществ скорость миграции зависит как от коэффициента распределения вещества между мицеллой и водным буферным раствором, так и от электрофоретической подвижности вещества в отсутствии мицеллы.
Поскольку механизм разделения в МЭКХ для нейтральных и слабо ионизированных веществ, главным образом, хроматографический, миграция вещества и разрешение могут быть охарактеризованы с помощью фактора удерживания вещества (к), также известного как концентрационный коэффициент распределения (Dm ), который представляет собой отношение количество разделяемого вещества, находящегося в мицелле, к количеству данного вещества в подвижной фазе.
Для нейтральных соединений к определяется как:
tR - время миграции вещества,
t0 - время анализа неудерживаемого соединения (определяемое с помощью маркера электроосмотического тока, не входящего в мицеллу, например, метанола),
tmc - время миграции мицеллы (изменяется с помощью маркера мицеллы, такого как Судан III, который мигрирует, полностью находясь в мицеллах),
K - коэффициент распределения вещества,
\/s - объём мицеллярной фазы,
VM - объём подвижной фазы.
Аналогично, разрешение пиков двух близко мигрирующих веществ определяется как:
где:
где:
N - число теоретических тарелок для одного из веществ, а - селективность,
ка и kb - факторы удерживания для обоих веществ соответственно (kb> ka).
Подобные, но не идентичные, уравнения для значений к и Rs используются и в случае разделения заряженных веществ.
ОПТИМИЗАЦИЯ
Основными параметрами, которые следует принимать во внимание при разработке методик разделения в МЭКХ, являются инструментальные параметры, а также параметры раствора электролита.
Инструментальные параметры
Напряжение. Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению. Однако увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, повышение температуры и, как результат, образование градиентов температуры и вязкости в буферном растворе, находящемся в капилляре. Данный эффект особенно характерен для буферных растворов с высокой электропроводностью и содержащих мицеллы. Неудовлетворительная тепловая конвекция приводит к расширению полосы и уменьшает разрешение.
Температура. Изменения температуры капилляра влияют на коэффициент распределения вещества между буферным раствором и мицеллой, на критическую концентрацию мицеллообразования и вязкость буферного раствора. Данные параметры вносят вклад в величину времени удерживания вещества.
Использование хорошей охлаждающей системы улучшает воспроизводимость времен миграции веществ.
Капилляр. Как и в случае капиллярного электрофореза со свободным раствором размеры капилляра (длина и внутренний диаметр) влияют на время анализа и эффективность разделения. Увеличение как эффективной, так и общей длины капилляра может ослабить электрическое поле (в случае работы при постоянном напряжении), увеличить время миграции и улучшить эффективность разделения. Внутренний диаметр контролирует тепловую конвекцию (для определённого буферного раствора и электрического поля) и, соответственно, расширению полосы вещества.
Параметры раствора электролита
Тип и концентрация поверхностно-активного вещества. Тип поверхностноактивного вещества таким же образом, как и неподвижная фаза в хроматографии, влияет на разрешение, поскольку изменяет селективность разделения. Величина lg к нейтрального соединения линейно увеличивается при увеличении концентрации поверхностно-активного вещества в подвижной фазе. Поскольку разрешение в МЭКХ достигает максимума при приближении величины к к фтс : 10 , изменение концентрации поверхностно-активного вещества в подвижной фазе изменяет величину разрешения.
Величина рН буферного раствора. Несмотря на то что величина pH не изменяет коэффициент распределения неионизированных веществ, она может
изменять электроосмотический поток в капиллярах с немодифицированной поверхностью. Уменьшение рН буферного раствора уменьшает электроосмотический поток и, тем самым, увеличивает разрешение нейтральных веществ в МЭКХ вследствие увеличения времени анализа.
